肽分析反相色譜柱能夠拓寬從蛋白質組學應用到肽圖分析應用的pH范圍，同時提供出色的溫度穩定性。肽分析反相色譜柱填料表面帶少量正電荷，可與含TFA的標準洗脫液或弱酸性改性劑（如甲酸）一起使用，分析人員無需在可獲得清晰峰形的反相洗脫液與能夠避免MS信號減弱的洗脫液之間折衷。
通過氯硅烷把疏水相鍵合到硅膠基質上就形成了反相HPLC吸附劑，這些硅膠基質分子上有一個能附著疏水基團的活性氯基。形成疏水相的烴基通常是十八碳(C18)、八碳(C8)或四碳(C4)的線性脂肪族烴。烴鏈的長度在蛋白質分離效果上一般沒有什么不同。對于肽和少于5000道爾頓的小分子蛋白質選用C18色譜柱。小的分子和親水的肽通常在小孔的C18柱子上分離得較好。大于5000道爾頓的蛋白質或小分子多肽非常疏水，選用C4色譜柱。C8柱與C18色譜柱的應用差不多，但分離個別肽時有時表現出不同的選擇性和分離能力。苯基柱沒有C4柱子那么疏水，所以對有些多肽表現出*的選擇性。反相表面的細微差別有時會造成RP-HPLC對多肽選擇性的不同，可以利用這一點來優化特定肽的分離。
不同的反相吸附劑在分離蛋白質酶消化物中的肽碎片時可能表現出不同的選擇性。用兩種RP-HPLC色譜柱分離β-乳球蛋白A的胰蛋白酶消化物碎片，結果表明不同的相有時對肽的反相分離具有微小的影響。與通常使用的C18色譜柱相比，C4柱的保留時間稍短，肽碎片洗脫圖形也有某些程度上的不同。測試不同的色譜柱是確定哪個柱子分離度的實用方法。有些實驗室利用肽分析反相色譜柱的選擇性差異來進行肽的二維分離。
更新時間：2019-05-28 
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